ANTIBIÓTICOS Y SUS RESISTENCIAS. CÓMO COMIENZA Y LA PROBLEMÁTICA ACTUAL.

Fotografía de Alexander Fleming en su laboratorio.

URL: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Alexander_Fleming.jpg. Attribution: By Calibuon at English Wikibooks [Public domain], via Wikimedia Commons. (https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=11012517).

El descubrimiento de la penicilina se atribuye a Alexander Fleming, que ganó el Premio Nobel en 1945. Alexander Fleming es un médico escocés que trabajó como médico microbiólogo en el Hospital St. Mary de Londres hasta el comienzo de la Primera Guerra Mundial. Se dedicaba a la fabricación de vacunas y sueros. Fue Almorth Edward Wright quien despertó el interés de Fleming por nuevos tratamientos para las infecciones. Durante la guerra fue médico militar, y la gran mortalidad causada por las heridas de metralla infectadas en los hospitales de campaña llevó a Fleming a buscar un nuevo antiséptico que evitase estas infecciones. Aunque siglos atrás ya se comenzaron a observar las propiedades bactericidas de los mohos, fue Fleming quien descubrió la penicilina, de forma “casual”, el 28 de septiembre de 1928, estudiando cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus en el laboratorio Hospital St. Mary. Tiró varios cultivos contaminados a una bandeja que contenía lysol. En una de las placas observó que alrededor del hongo contaminante había un halo de transparencia, que indicaba destrucción celular. Posteriormente Fleming aisló y cultivó el hongo en otra placa en la que colocó varios microorganismos y observó cuáles eran sensibles. Fue Charles Thom quien identificó el hongo como Penicillium notatum.

La penicilina tiene varias presentaciones, la producida de modo natural es la bencilpenicilina o penicilina G, empleada en la clínica. Posteriormente se modificó la molécula de penicilina G para elaborar penicilinas sintéticas. En la actualidad, existen múltiples derivados sintéticos de la penicilina, como la cloxacilina y la amoxicilina, entre otros.

El descubrimiento de la penicilina en 1928 y otros antibióticos en el siglo XX transformó la medicina y supuso un logro médico en la época, salvando millones de vidas. Los años 1950 a 1970 representaron la edad de oro del descubrimiento de antibióticos, descubriéndose innumerables clases nuevas de antimicrobianos para tratar enfermedades previamente incurables, como la tuberculosis y la sífilis.

Así, la penicilina tuvo éxito en el control de las infecciones bacterianas en la Segunda Guerra Mundial. Sin embargo, poco tiempo después comenzaron a aparecer las primeras resistencias a este antibiótico, principalmente debido al uso indebido. Este fenómeno fue previsto por el propio Alexander Fleming, quien dijo, textualmente (inglés): The time may come when penicillin can be bought by anyone in the shops. Then there is the danger that the ignorant man may easily under-dose himself and by exposing his microbes to nonlethal quantities of the drug make them resistant ("Puede llegar el momento en el que cualquier persona en las tiendas pueda comprar penicilina. Existe el riesgo de que las personas ignorantes puedan dosificarse a dosis bajas y exponer a los microbios a cantidades no letales de la droga, haciéndolos resistentes").

Debido a la aparición de estas resistencias, comenzaron a desarrollarse nuevos antibióticos betalactámicos, y ya en esa misma década (1947) se identificó el primer caso de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. La vancomicina se introdujo en 1972 para el tratamiento de S. aureus y estafilococos coagulasa negativos resistentes a la meticilina. Sin embargo, pocos años después se notificaron casos de resistencia a la vancomicina en estafilococos coagulasa negativos. La evolución de la resistencia a los antimicrobianos en el caso de Enterococcus faecium fue similar durante la década de los 80. La resistencia de esta bacteria a la penicilina se describió en 1983, a la vancomicina en 1987 y, a finales de la década de los 90, se descubrió su resistencia a la linezolida.

Desde finales de la década de 1960, la industria farmacéutica introdujo muchos antibióticos nuevos para resolver este problema, pero la reducción de los incentivos económicos y los exigentes requisitos reglamentarios llevaron a la falta de desarrollo de nuevos fármacos.

Numero de antimicrobianos nuevos aprobados versus el intervalo de años.

Imagen tomada del artículo: Ventola CL. (2015) The Antibiotic Resistance Crisis: Part 1: Causes and Threats. Recuperado de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4378521/

La resistencia a los antimicrobianos supone hoy en día una gran amenaza, y puede llevar a grandes epidemias si no se toman medidas preventivas. Factores como la prescripción incorrecta de antibióticos (por ejemplo el empleo de concentraciones subterapéuticas), su uso como suplemento para el crecimiento en ganado (que posteriormente es consumido por el hombre), el uso agrícola de los mismos (los antibióticos administrados al ganado se excretan en la orina y las heces, y se dispersan en el medio ambiente a través de fertilizantes, aguas subterráneas y corrientes superficiales, o su empleo como pesticidas en algunos países), entre otros, contribuyen a la aparición de bacterias resistentes.

Lamentablemente, se han observado resistencias a casi todos los antibióticos que existen. El CDC (Centers for Disease Control and Prevention) declaró en 2013 que la raza humana se encuentra en la "era post-antibiótica" y, en 2014, la Organización Mundial de la Salud (OMS) advirtió que la crisis de resistencia a los antibióticos se está volviendo preocupante. Las bacterias multirresistentes han sido declaradas como una amenaza sustancial para la salud pública. La mayor amenaza actual la representan las especies resistentes de S. aureus (resistentes a la meticilina y vancomicina) y Enterococcus (resistentes a la vancomicina). Entre las bacterias gram negativas, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Escherichia coli y Neisseria gonorrhoeae, entre otros, están ocasionando múltiples problemas de resistencias.

Existen hoy en día múltiples programas de monitorización de estas amenazas, pero aún son necesarios más esfuerzos coordinados para implementar nuevas políticas, renovar los esfuerzos de investigación e intentar manejar esta crisis actual.

Bibliografía:

- Fleming A (1945-12-11). "Nobel Price Lecture" (PDF). nobelprize.org. Retrieved 2018-03-01.

- Ventola CL. The Antibiotic Resistance Crisis: Part 1: Causes and Threats. Pharmacy and Therapeutics. 2015;40(4):277-283.

- Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. CDC. Disponible en: https://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/pdf/ar-threats-2013-508.pdf

- Review on Antimicrobial Resistance. amr-review.org. Retrieved 20 May 2016.

- Centers for Disease Control and Prevention, Office of Infectious Disease Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. Apr, 2013. Disponible en: http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013

SECUENCIACIÓN DE ADN. DESCUBRIMIENTO Y MÉTODOS.

Los esfuerzos inicales para poder secuenciar los ácidos nucleicos y conocer su composición nucleotídica dieron muy pocos resultados, ya que presentaban algunos inconvenienes; era muy caro y tedioso secuenciar incluso fragmentos muy pequeños, de unos 5-10 nucleótidos. 

Pero todo esto cambia a partir del año 1970, ya que se desarrollan dos métodos, que facilitan el camino hacia el gran objetivo impuesto de conocer la secuencia de nucleótidos que compone el ADN.

- El primero de dichos métodos se desarrolla en 1977, conocido como el método químico de Maxam y Gilbert, en honor a los investigadores que lo desarrollaron.

Walter Gilbert nació en 1932, en Boston. Se graduó en Física por la Universidad de Harvard en 1953. Realizó sus estudios de doctorado en Matemáticas en la Universidad de Cambridge en 1957. Regresó a Harvard como profesor de física en 1959,  pero su campo de estudio fue variando y en 1968, fue nombrado profesor asociado de Bioquímica. Fue durante la década de los 60, cuando Gilbert logra demostrar la hipótesis de Monod y Jacob, mediante una serie de ensayos llevados a cabo en E.coli, evidenciando que la regulación de los procesos transcripcionales es controlada por la interacción de proteínas represoras con secuencias de ADN específicas.

Unos años más tarde, junto con un estudiante que trabajaba en su laboratorio, Allan Maxam, desarrolla un método de secuenciación químico, el cual puede describirse en 3 etapas:

      - marcaje radiactivo del ADN- por acción de una polinucleótido quinasa en los extremos del fragmento de ADN.

      - hidrólisis química selectiva- se divide la muestra de ADN en cuatro alícuotas y se fragmenta el ADN mediante el uso de reactivos químicos en cuatro reacciones químicas distintas.

      - análisis de los productos- los fragmentos de ADN generados en el paso anterior son separados en función de su tamaño, mediante una electroforesis.

En 1980, Gilbert, junto a Paul Berg y Frederick Sanger, obtuvo en Premio Nobel de Química por el desarrollo de los métodos de secuenciación del ADN.

A lo largo de su carrera científica, Gilbert ha fundado varias compañías biotecnológicas y ha participado en el Proyecto Genoma Humano, que permitió secuenciar la mayor parte del genoma.

- El segundo de dichos métodos fue desarrollado también el mismo año que el anterior, en 1977. Frederick Sanger nació en Rendcombe (Inglaterra) en 1971. Estudió en la escuela Bryanston y más tarde obtuvo el título de Bachiller en St. Jhon's College de Cambridge. Trabajó en el departamento de investigaciones desde 1939, hasta doctorarse en bioquímica en 1943. En un principio, Sanger se dedicó al estudio de las proteínas, centrándose en determinar la estructura de la molécula, adoptando métodos de investigación que posteriormente fueron copiados por laboratorios de todo el mundo. En 1955, consiguió por fin su objetivo, lo que abrió el camino hacia la comprensión de la estructura general de la proteína y su sínteis y la de otras, que podían ser usadas para el tratamiento de distintas enfermedades. En 1958, Sanger fue galardonado con el Premio Nobel de Química.

En 1962 se traslada al British Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, donde se fija como objetivo, idear un método que le permita determinar la secuencia de los nucleótidos en el ADN, lo cual consiguió en 1977. El método empleado, conocido como método enzimático, se basa en la interrupción prematura de la síntesis de ADN, mediante la inclusión de dideoxinucleósidos trifosfato marcados con fluorocromos, que no contienen el grupo -OH en el carbono 3' de la desoxirribosa y por tanto, impiden la elongación de la cadena, interrumpiendo la síntesis llevada a cabo por la ADN polimerasa. De esta manera, se generan una serie de moléculas de ADN, en las que cada una termina en un dideoxinucleótido específico. Estos fragmentos de ADN serán posteriormente separados, en función de su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa.

Esta técnica de secuenciación permitió el análisis a gran escala de fragmentos de ADN de gran tamaño, lo que entre otras cosas, permitió la realización del Proyecto Genoma Humano.

Sanger en 1980, junto con Gilbert y Berg, fue galardonado con el Nobel de Química, convirtiéndose en la 4ª persona en la historia de los Nobel en ser premiada dos veces con tan honorífico galardón.

En 1983 Sanger se retiró del British Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology y murió en Cambridge, el 19 de Noviembre del 2013.

En los últimos años, se han desarrollado nuevos métodos que permiten secuenciar el ADN de forma más rápida y con menor coste. Todos estos nuevos métodos se agrupan bajo el término de "Secuenciación de Nueva Generación" y todas ellas se basan en el método de Sanger, pero han permitido reducir el coste del proceso y aumentar la velocidad del método, optimizando de forma muy notable el proceso.

La determinación de las secuencias de nucleótidos que conforman los genes, ha permitido estudiar no sólo la estructura de sus productos proteicos, sino también las características de las secuencias que regulan la expresión de los mismos, además de descubrir la causa de numerosas enfermedades e incluso, definir tratamientos individualizados en función de la composición genética de los pacientes.

BIBLIOGRAFÍA:

- Geoffrey M. Cooper & Robert E. Hausman. Boston University. La Célula (6ª Edición, 2011). Editorial Marbán
- Ángel Herráez. Biología Molecular e Ingeniería Genética. (2ª Edición, 2012). Editorial Elsevier.

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y SU GRAN REPERCUSIÓN EN EL MUNDO DE LA GENÉTICA. UN POCO DE HISTORIA.

En 1985 Kary Mullis desarrolló una nueva técnica de laboratorio que ha tenido gran repercusión en el mundo de la genética: la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés: Polymerase Chain Reaction). Esta técnica tuvo un gran impacto en todos los campos relacionados con la biología molecular. La técnica fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary B. Mullis.

Kary Banks Mullis se licenció en química en el Georgia Institute of Technology, Estados Unidos. En 1966 estudió bioquímica en California, realizando un doctorado en la Universidad de Berkeley. En 1972 trabajó como investigador en cardiología pediátrica en Kansas, adquiriendo formación en biología. Posteriormente trabajó como investigador en química farmacéutica en la Universidad de San Francisco, en el campo de las endorfinas. En 1979 fue contratado por la compañía californiana Cetus Corporation, donde trabajaba con oligonucleótidos (moléculas cortas de ADN o ARN). En 1983 desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, una de las técnicas centrales en biología molecular y que le hizo ganador del Premio Nobel de Química.

Un resumen de la historia de la Reacción en Cadena de la Polimerasa:

El 25 de abril de 1953 James D. Watson y Francis Crick describieron una estructura diferente del ADN, la estructura de doble hélice, que muestra que el ADN tiene dos cadenas con bases complementarias que corren en direcciones. Ambos ganaron el Premio Nobel en 1962.

En la misma década, Arthur Kornberg estudió el mecanismo de la replicación del ADN e identificó la primera ADN polimerasa, que creaba ADN en una sola dirección y requería un cebador para iniciar la copia de la cadena molde. Kornberg ganó el Premio Nobel en 1959.

En la década de los 60, H. Gobind Khorana realizó importantes avances en la elucidación del código genético. Khorana fue pionero en muchas de las técnicas de fabricación y uso de oligonucleótidos sintéticos de ADN, que ayudaban a la ADN polimerasa a copiar los segmentos deseados. En 1968, Khorana recibió el Premio Nobel por su trabajo en el Código genético. En el mismo período, Kjell Kleppe, del mismo laboratorio de Khorana, visualizó el uso de un sistema de dos cebadores, que podría ayudar en la replicación del ADN.

En 1976, Thomas Brock comunicó el aislamiento de una ADN polimerasa de T. aquaticus. Se observó que conservaba su actividad a temperaturas superiores a 75 °C.

En 1977, Frederick Sanger trabajó en un método para determinar la secuencia de ADN, empleando un cebador de oligonucleótidos, ADN polimerasa y precursores de nucleótidos modificados que bloqueaban la extensión adicional del cebador de manera dependiente de la secuencia. Por esta innovación fue galardonado con el Premio Nobel en 1980.

En 1979 Cetus Corporation contrató a Kary Mullis para sintetizar oligonucleótidos para diversos proyectos de investigación. Mullis comenzó sintetizando los oligonucleótidos a mano, y posteriormente evaluó prototipos para sintetizadores automáticos. En 1983, Mullis propuso una técnica alternativa basada en el método de secuenciación de Sanger. Mullis tuvo la idea de agregar un segundo cebador a la cadena opuesta y observó que el uso repetido de la ADN polimerasa provocaría una reacción en cadena que amplificaría un segmento de ADN específico, descubriendo así la tecnología de PCR. Experimentos posteriores incluyeron ciclos térmicos repetidos y pequeños segmentos dirigidos de un gen clonado. En septiembre de 1984, Tom White y Mullis diseñaron experimentos que podrían demostrar convincentemente que la PCR podría funcionar en el ADN genómico. En noviembre de 1984, los productos de amplificación se analizaron mediante Southern blotting, que confirmó el aumento en la cantidad de los segmentos de ADN esperados. El ADN amplificado fue clonado y secuenciado por los investigadores, y la patente fue obtenida en 1987. Fue el 13 de octubre de 1993 cuando Kary Mullis recibió, como comentamos, el Premio Nobel de Química.

Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa:

La técnica PCR se basa en el uso de la capacidad de la enzima ADN polimerasa para sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a una cadena molde. Debido a que esta enzima sólo agrega nucleótidos a un grupo 3'-OH preexistente, necesita un cebador o primer al que pueda agregar el primer nucleótido e incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Por ello, permite delinear una región específica de la secuencia que queramos amplificar. Al final de la reacción de PCR, habremos generado una gran cantidad de copias (llamadas amplicones) de un fragmento de DNA específico. El fragmento amplificado se visualiza posteriormente empleando técnicas de separación de fragmentos de DNA.

Componentes para la reacción en cadena:

El objetivo de la PCR es obtener múltiples copias de un fragmento de ADN, para después poder visualizar este fragmento. El ADN que queremos amplificar se conoce como ADN molde. La enzima capaz de generar una copia de ADN a partir del ADN molde es la ADN polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima. Además, se suelen añadir cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).

Como comentamos, la ADN polimerasa únicamente es capaz de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de ADN. Empleamos los primers o cebadores (secuencias de nucleótidos cortas de entre 10 y 30 pares de bases) de DNA de cadena sencilla, que delimitan el fragmento a amplificar. Además, se precisan nucleótidos libres, para que las ADN polimerasas creen la cadena complementaria a la cadena molde, mediante la incorporación de los mismos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

Proceso: primero es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen (fase de desnaturalización), que se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94°C. Posteriormente desciende la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al ADN molde (fase de hibridación), normalmente a temperaturas entre 35 y 60°C Finalmente, la ADN polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores (fase de elongación o extensión). La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa esta temperatura suele ser de 72°C.

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Actualmente, la PCR es una técnica indispensable y frecuentemente empleada en los laboratorios clínicos y de investigación con una amplia variedad de aplicaciones.

- Mullis, KB 1993. Conferencia con motivo de la recepción del Premio Nobel. Disponible en: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullislecture.html

- de Castro, AMP (2011). Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Artículo Docente. Universitat Politècnica de València. Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural - Escola Tècnica Superior d'Enginyeria Agronòmica i del Medi Natural. Disponible en: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf

- Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195.