En 1985 Kary Mullis desarrolló una nueva técnica de
laboratorio que ha tenido gran repercusión en el mundo de la genética: la
reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés: Polymerase Chain Reaction).
Esta técnica tuvo un gran impacto en todos los campos relacionados con la
biología molecular. La técnica fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary B. Mullis.
Kary
Banks Mullis se
licenció en química en el Georgia Institute
of Technology, Estados Unidos. En 1966 estudió bioquímica en California, realizando
un doctorado en la Universidad de Berkeley. En 1972 trabajó como investigador
en cardiología pediátrica en Kansas, adquiriendo formación en biología. Posteriormente
trabajó como investigador en química farmacéutica en la Universidad de San
Francisco, en el campo de las endorfinas. En 1979 fue contratado por la
compañía californiana Cetus Corporation,
donde trabajaba con oligonucleótidos (moléculas cortas de ADN o ARN). En 1983
desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, una de las
técnicas centrales en biología molecular y que le hizo ganador del Premio Nobel de Química.
Un
resumen de la historia de la Reacción en Cadena de la Polimerasa:
El
25 de abril de 1953 James D. Watson
y Francis Crick describieron una
estructura diferente del ADN, la estructura de doble hélice, que muestra que el ADN tiene dos cadenas con bases
complementarias que corren en direcciones. Ambos ganaron el Premio Nobel en
1962.
En
la misma década, Arthur Kornberg
estudió el mecanismo de la replicación del ADN e identificó la primera ADN polimerasa, que creaba ADN en una
sola dirección y requería un cebador para iniciar la copia de la cadena molde.
Kornberg ganó el Premio Nobel en 1959.
En
la década de los 60, H. Gobind Khorana
realizó importantes avances en la elucidación del código genético. Khorana fue
pionero en muchas de las técnicas de fabricación y uso de oligonucleótidos sintéticos de ADN, que ayudaban a la ADN
polimerasa a copiar los segmentos deseados. En 1968, Khorana recibió el Premio
Nobel por su trabajo en el Código genético. En el mismo período, Kjell Kleppe,
del mismo laboratorio de Khorana, visualizó el uso de un sistema de dos
cebadores, que podría ayudar en la replicación del ADN.
En
1976, Thomas Brock comunicó el aislamiento de una ADN polimerasa de T. aquaticus. Se observó que conservaba su
actividad a temperaturas superiores a 75 °C.
En
1977, Frederick Sanger trabajó en un
método para determinar la secuencia de ADN, empleando un cebador de
oligonucleótidos, ADN polimerasa y precursores de nucleótidos modificados que
bloqueaban la extensión adicional del cebador de manera dependiente de la
secuencia. Por esta innovación fue galardonado con el Premio Nobel en 1980.
En
1979 Cetus Corporation contrató a
Kary Mullis para sintetizar
oligonucleótidos para diversos proyectos de investigación. Mullis comenzó
sintetizando los oligonucleótidos a mano, y posteriormente evaluó prototipos
para sintetizadores automáticos. En 1983, Mullis propuso una técnica
alternativa basada en el método de secuenciación de Sanger. Mullis tuvo la idea
de agregar un segundo cebador a la cadena opuesta y observó que el uso repetido
de la ADN polimerasa provocaría una reacción en cadena que amplificaría un
segmento de ADN específico, descubriendo así la tecnología de PCR. Experimentos
posteriores incluyeron ciclos térmicos repetidos y pequeños segmentos dirigidos
de un gen clonado. En septiembre de 1984, Tom White y Mullis diseñaron
experimentos que podrían demostrar convincentemente que la PCR podría funcionar
en el ADN genómico. En noviembre de 1984, los productos de amplificación se
analizaron mediante Southern blotting,
que confirmó el aumento en la cantidad de los segmentos de ADN esperados. El
ADN amplificado fue clonado y secuenciado por los investigadores, y la patente
fue obtenida en 1987. Fue el 13 de octubre de 1993 cuando Kary Mullis recibió,
como comentamos, el Premio Nobel de Química.
Fundamento de
la Reacción en Cadena de la Polimerasa:
La
técnica PCR se basa en el uso de la capacidad de la enzima ADN polimerasa para
sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a una cadena molde. Debido a
que esta enzima sólo agrega nucleótidos a un grupo 3'-OH preexistente, necesita
un cebador o primer al que pueda
agregar el primer nucleótido e incorporar nucleótidos complementarios a la
cadena molde. Por ello, permite delinear una región específica de la secuencia
que queramos amplificar. Al final de la reacción de PCR, habremos generado una
gran cantidad de copias (llamadas amplicones) de un fragmento de DNA específico.
El fragmento amplificado se visualiza posteriormente empleando técnicas de
separación de fragmentos de DNA.
Componentes
para la reacción en cadena:
El
objetivo de la PCR es obtener múltiples copias de un fragmento de ADN, para
después poder visualizar este fragmento. El ADN que queremos amplificar se
conoce como ADN molde. La enzima
capaz de generar una copia de ADN a partir del ADN molde es la ADN polimerasa. La reacción se lleva a
cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima. Además, se suelen
añadir cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio
(MgCl2).
Como
comentamos, la ADN polimerasa únicamente es capaz de añadir nucleótidos al
extremo 3’ libre de una doble cadena de ADN. Empleamos los primers o cebadores
(secuencias de nucleótidos cortas de entre 10 y 30 pares de bases) de DNA de
cadena sencilla, que delimitan el fragmento a amplificar. Además, se precisan nucleótidos libres, para que las ADN
polimerasas creen la cadena complementaria a la cadena molde, mediante la
incorporación de los mismos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a
la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato
(dNTPs).
Proceso:
primero es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas
de DNA se separen (fase de
desnaturalización), que se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor
de 94°C.
Posteriormente desciende la temperatura para permitir que los cebadores se unan
por complementariedad al ADN molde (fase
de hibridación), normalmente a temperaturas entre 35 y 60°C Finalmente,
la ADN polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’
libre de la región en que han hibridado los cebadores (fase de elongación o extensión). La temperatura a la que se lleva a
cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq
polimerasa esta temperatura suele ser de 72°C.
URL:
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction.svg.
Attribution: By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=32003643
Actualmente,
la PCR es una técnica indispensable y frecuentemente empleada en los
laboratorios clínicos y de investigación con una amplia variedad de
aplicaciones.
- Mullis, KB
1993. Conferencia con motivo de la recepción del Premio Nobel. Disponible en:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullislecture.html
- de Castro, AMP (2011). Reacción en cadena de la polimerasa
(Polymerase Chain Reaction, PCR). Artículo Docente. Universitat Politècnica de
València. Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural
- Escola Tècnica Superior d'Enginyeria Agronòmica i del Medi Natural.
Disponible en: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf
- Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying,
detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195.
Me pareció muy interesante el articulo!
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